RDEB ген терапиясын жеткирүүнү жакшыртуу

Бул долбоордо изилдөөчүлөр лабораторияда пациенттин клеткаларындагы бузулган RDEB генин (коллаген-7) алмаштыруу жана адамдын клеткаларына генди түзөтүү процедураларын түздөн-түз жеткирүү үчүн ген терапиясынын ыкмаларын түзүштү. Көптөгөн адамдар адамдын вирустары менен ооругандыктан жана адамдын вирустарын колдонуу менен ген терапиясынын натыйжалуулугун төмөндөтүүчү иммундук жооп болушу мүмкүн болгондуктан, жаңы система чочко вирусун колдонот. Ал ошондой эле терс таасирлерди пайда кылуу ыктымалдыгы аз, анткени ал вирусту эки бөлүккө, ген терапиясын камтыган, бирок вирус гендери жок "ампликон" векторуна жана өзүн көбөйтө албаган, бирок ген терапиясын түзүүгө жардам берген "жардамчы" вируска бөлөт.

Жаңы вирус системасы пациенттин тери клеткаларына жаңы иштеген Коллаген-7 рецептин кошо алат, ошондой эле пациенттин тери клеткаларындагы генетикалык өзгөрүүнү оңдоо үчүн генди оңдоо куралдарын кошо алат. Биринчиси убактылуу RDEB теринин жакшыраак жабышып калышына жардам бере алат, ал эми экинчиси узак мөөнөттүү жакшыртууга алып келиши мүмкүн.

Кийинки кадам тери моделдеринде бул ген терапиясынын варианттарын сынап көрүү болуп саналат, алар терини дарылоо ыкмаларына айландырылат, алар жараатты айыктыруу жана негизги генетикалык өзгөрүүнү узак мөөнөттүү оңдоону сунуштайт.

Окумуштуулар жаңы ген терапиясын жасоо үчүн лабораторияда өстүрүлгөн клеткаларды колдонушту.
Алардын максаты ген терапиясын натыйжалуураак жана көбүрөөк көлөмдө жасай алуу болуп саналат жана алардын алгачкы эксперименттери мунун мүмкүн экенин көрсөтүп жатканын билдиришүүдө.

Жетектөөчү илимий кызматкер:

Доктор Анхелес Менсиа сейрек кездешүүчү оорулардын молекулярдык диагностикасы боюнча 20 жылдан ашык тажрыйбасы бар, кийинки муундун секвенирлөөсүнө негизделген диагностикалык каражаттарды, анын ичинде буллоза эпидермолизинин диагностикасы үчүн панелдерди долбоорлоого, валидациялоого жана которууга катышкан. Ал генди оңдоо үчүн молекулярдык куралдарды иштеп чыгууда чоң тажрыйбасы бар, алар клиникага өткөрүлүп берилет.

Кош изилдөөчүлөр:

Доктор Сильвия Гомес-Себастьян Мадрид университетинин Медицина факультетинин доценти. Анын изилдөөчү катары алгачкы жылдарында герпесвирустар менен иштеген, вирустарды генетикалык манипуляциялоо боюнча 20 жылдан ашык тажрыйбасы бар. Ал Friedreich's Ataxia пациентинин клеткаларында фратаксинди (FA) калыбына келтирүү үчүн толук FRDA локусун алып жүргөн HSV-1 ампликон векторлору менен иштеген.

Доктор Родольфо Муриллас CIEMATтын улук окумуштуусу, теринин биологиясы, анын ичинде эпидермалдык трансгенез, теринин гендик терапиясы үчүн вирустук векторлорду иштеп чыгуу жана ген аркылуу буллоза дистрофиялык эпидермолизди коррекциялоо үчүн эксперименталдык протоколдорду иштеп чыгуу жаатында чоң тажрыйбасы бар. түзөтүү.

Доктор Мирентху Сантос CIEMATтын улук окумуштуусу, клетка культуралары, баштапкы маданияттар, молекулярдык жана клеткалык биология, клетка цикли жана сигнал берүү жолдору боюнча чоң тажрыйбасы бар.

Доктор Марта Гарсиа Карлос III де Мадрид UC3M университетинин кыртыш инженериясынын профессору. Доктор Гарсиа генодерматозду молекулярдык изилдөөгө көптөн бери кызыкдар жана сейрек кездешүүчү дерматологиялык оорулар үчүн гумандаштырылган теринин моделдерин иштеп чыгуу боюнча таанылган эксперт.

Диана де Прадо 2023-жылдан баштап доктор Менсия менен Мурилластын жетекчилиги астында докторантурада иштеп жаткан аспирант.

«Акыркы жылдарда RDEB үчүн гендик терапиянын жетишкендиктери бизге эффективдүү жана актуалдуу түрдө колдонууга жөнөкөй, бирок бейтаптардын жашоосун бир топ жакшырта турган дарылоону болжолдоого мүмкүндүк берет.

Бул векторлорду колдонуу менен генди ийгиликтүү редакциялоо патогендик аллельдердин экспрессиясын жок кылуу үчүн аллельге мүнөздүү CRISPR/Cas куралдары менен басымдуулук кылган EBS же EBD сыяктуу ЭБнын башка түрлөрүн дарылоо мүмкүнчүлүгүн ачат.

– Доктор Анхелес Менсия

Гранттын аталышы: RDEB терапиясы үчүн коопсуз псевдорабиялык герпесвируска негизделген векторлорду түзүү үчүн жаңы платформа.

Ген терапиясы мутацияларды оңдоонун ар кандай стратегиялары аркылуу рецессивдүү дистрофиялык EB (RDEB) үчүн потенциалдуу дарылоочу дарылоо катары пайда болгон. Вирустук векторлор - мутацияларды оңдоо үчүн зарыл болгон нерселерди ташуу үчүн же жабыркаган протеинди калыбына келтирүүгө жардам берген дени сак гендерди ташуу үчүн колдонулган лабораториялык шаймандар. Бул лабораториялык аспаптар, адатта, аденовирустар же герпес вирусу сыяктуу ар кандай вирустардан келет.

Буга чейин биздин топ аденовирустан алынган векторлор VII коллагенди калыбына келтирүү жана in vivo дерма менен эпидермис ортосундагы адгезияны калыбына келтирүү үчүн пайдалуу экенин көрсөткөн. Мындан тышкары, вирустук векторлорду долбоорлоодогу жаңы жетишкендиктер RDEB терисин кеңири жана натыйжалуу дарылоого карай прогресске мүмкүндүк берет. Герпес вирусунан алынган векторлор терини жугузууга табигый жөндөмдүүлүгүн эске алганда, ЭБ ген терапиясы үчүн чоң потенциалга ээ. Жакында болгон клиникалык сыноодо COL1A7 генинин функционалдык версиясын RDEB менен ооруган адамдардын жараларына жеткирүү үчүн жөнөкөй герпес вирусунун (HSV-1) вектору колдонулган. Натыйжалар жараатты айыктырууда олуттуу жакшыргандыгын жана ыйлаакчаларга каршылыктын жогорулагандыгын көрсөттү. Бул келечектүү натыйжалар RDEB терапиясы үчүн герпесвирустун векторлорунун потенциалын тастыктайт.
Ушуга байланыштуу биздин команда чочко псевдорабиясы вирусунун (Herpesviridae үй-бүлөсү) негизинде жаңы вектордук платформаны иштеп чыгууда, анын HSV-1ге караганда бир аз артыкчылыктары бар, анткени ал коопсуз жана чоң көлөмдө өндүрүү оңой. Бул жаңы платформанын негизинде, биз RDEB үчүн векторлорду түзүүнү сунуштайбыз, азыркы учурда клиникалык сыноолордо сыналып жаткандар менен салыштырууга болот, актуалдуу колдонуудан кийин узакка созулган оңдоо потенциалы бар.

Биздин команда RDEB дарылоо ыкмасын төңкөрүш кыла турган натыйжалуу жана башкарууга оңой актуалдуу дарылоо ыкмаларын иштеп чыгуу үчүн көп эмгектенди. Инвазивдүү жана оорутуучу хирургиялык процедураларды камтыган ген трансплантациясынын салттуу ыкмаларынан айырмаланып, биздин ыкма тери трансплантаттары менен дарылоого мүмкүн болбогон өнөкөт жаралардын жана жаралардын айыгышын жакшыртууга багытталган актуалдуу ген терапиясына багытталган. Биздин лаборатория туруктуу жакшыртууга жетишүү мүмкүнчүлүгү менен RDEB мутацияларын коррекциялоо үчүн молекулярдык генди оңдоо куралдарын иштеп чыгууда пионер болуп саналат. Жакында биз коллаген VII жана клиникага чейинки моделдердеги дермис менен эпидермистин ортосундагы адгезияны ийгиликтүү калыбына келтирдик.

Азыркы учурда биз бул максат үчүн векторлордун жаңы түрлөрүн иштеп чыгуудабыз, атап айтканда, герпес сымал вирустардан алынган, алар териге күчтүү табигый жөндөмдүүлүккө ээ жана ошондуктан РДБ менен ооруган адамдардын өнөкөт жараларын дарылоодо абдан натыйжалуу болушу мүмкүн. Биз сунуштап жаткан ыкмага окшош ыкмалардын негизинде Кошмо Штаттардагы акыркы клиникалык сыноолордун келечектүү натыйжалары бизге туура багытта бара жатканыбызга ишеним берет. Бул изилдөө линиясы RDEB дарылоону илгерилетүү үчүн чоң мүмкүнчүлүктү билдирет жана биз ишибизди энтузиазм жана катаалдуулук менен улантууга умтулабыз.

Биздин максат – бул оорудан жапа чеккендерге үмүт берип, алардын жашоо сапатын жакшыртуу. Биргелешип, биз RDEB менен күрөшкөндөр үчүн жаркыраган жана келечектүү келечекке карай жылышыбыз мүмкүн.

Герпес вирусунан алынган жаңы векторлор эпидермолизди дарылоодо чоң үмүт берет, бул алсыратуучу теринин абалынын потенциалдуу айыгышын сунуштайт. Бул дарылоонун клиникалык колдонууга жарамдуу болушу үчүн, бул векторлорду көп санда өндүрүү өтө маанилүү. Ампликон векторлору, герпестен алынган векторлордун субклассы, аларда вирустук гендер жок болгондуктан, коопсуз альтернатива болуп саналат. Бирок, алардын өндүрүш процесси жардамчы герпес вирустары менен биргелешип өндүрүү зарылдыгынан улам татаалдашат.

Биздин долбоор терапиялык векторлордун түшүмдүүлүгүн жогорулатууга, ошону менен акыркы препараттардын сапатын оптималдаштырууга багытталган инновациялык өндүрүш платформасын сунуштайт. Баштапкы фазада биз жардамчы вирустарды жок кылуу менен каалаган векторду өндүрүү үчүн PK15 продюсер клеткаларын өзгөрттүк. Бул ыкма вектор/жардамчы катышын терапиялык вектордун пайдасына ийгиликтүү өзгөртүп, бул өндүрүш стратегиясы үчүн концепциянын далили катары кызмат кылып, биздин дизайндын натыйжалуулугун көрсөттү. Алдыга карай, биз өндүрүш платформасын андан ары тактоо жана өркүндөтүү үчүн атайын клетка клондорун тандап жатабыз. Клондук популяция жардамчы векторлордун инактивациясын олуттуу түрдө жакшыртат, ошону менен терапевтикалык векторлордун чыгышын жогорулатат деп күтүлүүдө.

Улуу Британиянын DEBRA компаниясынын берешен каржылоосу менен мүмкүн болгон бул иш вектордук өндүрүштөгү олуттуу прогресс гана эмес, ошондой эле алдыңкы терапиялык варианттарды иштеп чыгууга карай маанилүү кадам болуп саналат. Бул эпидермолизден жапа чеккен бейтаптар үчүн үмүт жана жаркын келечекти сунуштайт, жаңы дарылоону жана жашоонун сапатын жакшыртат. 2024-жылга карата аткарылган иштер боюнча отчет.

Биздин долбоор буллоза эпидермолизинин (ББ) убактылуу жана туруктуу терапиялык муктаждыктарын чечүү үчүн иштелип чыккан герпесвирустун вектордук системасын изилдейт. Клиникага чейинки изилдөөлөрдөгү жетишкендиктердин аркасында EB бейтаптары жапа чеккен өнөкөт жараларды жана жараларды актуалдуу дарылоону иштеп чыгуу мүмкүн. Бул жетишкендиктер эки багытта жасалды: молекулярдык биология жана ген терапиясы.

Биринчи жетишкендик генди редакциялоо технологиясын колдонуу менен оорунун генетикалык мутацияларын коррекциялоо үчүн генетикалык куралдарды иштеп чыгуу болуп саналат. Биздин иш бизге COL80A7 генинин 1-экзонунда кеңири таралган мутация менен ооруган бейтаптардын клеткаларын коррекциялоо жана CRISPR менен дарыланган клеткалар коллаген VII(C7) өндүрүшүн жана дермис менен эпидермистин ортосундагы адгезияны калыбына келтирүүнү камсыз кылуу үчүн генди редакциялоонун эң көп түрдүү куралдарын, CRISPR системасын адаптациялоого мүмкүндүк берди.

Экинчи аванс пациенттердин терисине корректировкалоочу шаймандарды жеткирүү үчүн колдонулган унааларга тиешелүү. Акыркы жылдарда клиникалык сыноолор герпес вирустарынан алынган векторлордун крем түрүндө колдонулганда тери клеткаларын генетикалык жактан өзгөртүү мүмкүнчүлүгүн көрсөттү. Бул векторлор, мурунтан эле FDA жана EMA тарабынан клиникалык колдонууга бекитилген, EB менен ооруган бейтаптардын тери жараларынын колдонулган аймагында C7 экспрессиясын убактылуу калыбына келтирүүгө мүмкүндүк берет, жараатты айыктырууга көмөктөшөт. Бул жерде иштелип чыккан жаңы герпесвирус вектору жараатты тез айыктыруу мүмкүнчүлүгүнө ээ болгон бул убактылуу протеин жеткирүүнү кайталайт. Кошумчалай кетсек, CRISPR генди түзөтүү жөндөмүнүн интеграциясы ошол эле вектордук платформага коллагендик доменде мутацияларды алып жүргөн пациенттерде узакка созулган оңдоону дарылоо мүмкүнчүлүгүнө ээ болууга мүмкүндүк берет.

Бул долбоордо биз векторлордун эки түрүн тең курдук жана аларды чочколорго табигый түрдө таасир этүүчү герпес вирусунан (чочко псевдорабиясы вирусу) алынган жаңы герпес вектордук платформасында өндүрдүк. Бул платформа мүмкүн болгон артыкчылыктары менен жөнөкөй герпесте иштелип чыккан платформага альтернатива болуп саналат. Биринчиси, адамдарда бул векторго каршы иммунитеттин жоктугу, бул дарылоону жеңилдетет. Экинчиси - вирустук гендери жок вектор түрүндөгү дизайн, бул "ампликон" вектору деп аталат, ал азыраак уулуулугу, иммуногендүүлүгү жана векторунун экспрессиясынын жакшыртылган деңгээли жагынан пайдалуу. Бул герпесвирустук вектор үчүн ампликондун дизайнын иштеп чыгуу системага мүмкүн болушунча азыраак коштолгон репликацияланбаган вирусу (жардамчы вирус деп аталат) менен пайдалуу сандагы векторлорду өндүрүү үчүн системага өзгөртүүлөрдү талап кылат. Бул өзүн-өзү активдештирбеген платформа ийгиликтүү аяктады.

Биз псевдорабиялык герпесвирустун ампликон векторлорун, анын ичинде вирус өндүрүүчүсү катары иштеген клеткаларды, герпесвирустук контейнерлерге капсулдалган ампликондорду жана клеткалардын ичинде өзүнүн репликациясын болтурбоо үчүн иштелип чыккан модификацияланган жардамчы вирусту өндүрүү үчүн комплекстүү системаны иштеп чыктык. Бул система вектордук өндүрүштөгү негизги көйгөйлөрдү натыйжалуу чечип, ген терапиясынын технологиясындагы олуттуу прогрессти билдирет. Биз жаңы платформаны кошуу жолу менен C7 калыбына келтирүү үчүн векторду (ар кандай RDEB пациентин дермис-эпидермис адгезиясын убактылуу калыбына келтирүү үчүн дарылоо мүмкүнчүлүгү менен) жана C7 калыбына келтирүү үчүн дагы бир векторду (узак мөөнөттүү адгезияны калыбына келтирүү үчүн экзон 80де жогорку таралган мутацияны алып жүрүүчү бейтаптарды дарылоо мүмкүнчүлүгү менен) колдондук. Биз эки векторду тең сынап көрдүк жана экзон 80 мутациясын алып жүргөн пациенттен алынган кератиноцит линиясында алардын иштешин көрсөттүк. Биз жардамчы вектордон мүмкүн болгон эң аз контаминация менен векторлордун пайдалуу көлөмүн чыгарганга чейин өндүрүш протоколдорун деталдаштыруу үчүн мындан аркы иштер талап кылынат, бирок платформа функционалдык экендигин далилдеди жана анын өнүгүшү RDEB гана эмес, башка гендер менен байланышкан генодерматоздун башка формаларын да дарылоо үчүн жаңы герпесвирустук векторлорду өндүрүү үчүн чоң потенциалга ээ деп ишенебиз.

Кийинки кадам бул вектордук өндүрүштөрдү клиникага чейинки in vivo моделдеринде сынап көрүү болот, мисалы, иммундук жетишсиздик моделдеринде калыбына келтирилген пациенттин терисин жана RDEB моделин колдонуу менен биздин лабораторияда бар. Бул жаңы вектордук платформаны иштеп чыгуу рецессивдүү дистрофиялык ЭБны дарылоо үчүн гана эмес, ошондой эле тери ооруларын камтыган башка генетикалык шарттарды чечүү үчүн жаңы мүмкүнчүлүктөрдү ачат. CRISPR генди редакциялоону өнүккөн вирустук жеткирүү системалары менен айкалыштыруу менен биз EB бейтаптарын жараатты дароо айыктыруу жана негизги генетикалык кемчиликти узак мөөнөттүү оңдоону сунуш кылган актуалдуу өнүмдөр менен камсыз кылууну максат кылабыз. Биз бул ыкма EB жана ушул сыяктуу ооруларды дарылоонун ландшафтын өзгөртүү мүмкүнчүлүгүнө ээ деп эсептейбиз. (2025-жылдагы жыйынтык отчеттон.)