RDEB генин оңдоо үчүн CRISPR/Cas9

Долбоордун жарымына жеткенде, изилдөөчүлөр маанилүү этаптарынын жарымына ийгиликтүү жеткенин билдиришүүдө. Алардын генетикалык "тактары" күтүлгөндөн натыйжалуураак иштейт, бирок кичине. Бул аларга көбүрөөк муктаж болот жана долбоордун экинчи жарымында буга көңүл бурушат дегенди билдирет.

Жетектөөчү илимий кызматкер: Доктор Серхио Лопес-Манзанеда геномду редакциялоо боюнча күчтүү билими бар CIEMAT изилдөөчүсү.

Кош изилдөөчүлөр: Доктор Фернандо Ларчер – Карлос III де Мадрид университетинин биохимия кафедрасынын доценти жана CIEMAT (Эпителий биомедицина бөлүмү) бөлүмүнүн башчысы.

Алекс Бассонс Баскуньяна CIEMATдагы биомедициналык инновациялар бөлүмүнүн эпителий биомедицина тобунун докторанты.

кызматташуу: Доктор Паула Рио – фундаменталдык илимден клиникалык сыноолорго чейин генди редакциялоо жана тукум куума кан түзүүчү оорулардын ген терапиясы боюнча эл аралык деңгээлде таанылган эксперт.

"Бул вирустук эмес генди редакциялоо ыкмасы ар бир белгилүү мутацияны чечүүгө жөндөмдүү куралдар китепканасын түзүү үчүн арзан жана универсалдуу стратегияны издейт... Келечекте клиникага чейинки изилдөөлөрдө ген "жамаланган" түзөтүлгөн кератиноциттер жана пациенттердин фибробласттары колдонулат. биоинженердик тери эквиваленттерин түзүү».

– Доктор Серхио Лопес-Манзанеда

Гранттын аталышы: COL7A1 вирустук эмес геномду оңдоо.

Бул долбоордо биз бир чекиттик мутацияны эмес, аларды камтыган толук экзондорду оңдоо менен RDEBди пайда кылган кошуна мутациялардын топторун дарылоого багытталган геномду редакциялоо стратегиясын сунуштайбыз. Бул "генетикалык патчинг" CRISPR/Cas9 тутуму көмөктөшкөн табигый Гомологиялык Рекомбинация (HR) ДНКны оңдоо механизмине негизделген. "Жамааттар" кичинекей (300-400 базалык жуп) кош саптуу HDR донордук ДНК шаблондорун билдирет, алар бир нече чектеш экзондорду жабууга жетиштүү ген ырааттуулугунан түзүлөт, бул учурда коллагенди коддоочу VII тиби COL7A1 генине туура келет. Биздин максат - мутациялардын айрым топтору менен күрөшүү үчүн жеткиликтүү конкреттүү патчтарга ээ болуу идеясы менен бул технологияны колдонууну (натыйжалуулугун, коопсуздугун) мүнөздөө жана стандартташтыруу. Ex vivo RDEB пациенттин клеткасын дарылоо үчүн сунушталган вирустук эмес технология анын клиникага арзан баада которулушун жеңилдетет.

ЭБ үчүн эң келечектүү терапиялык ыкмалардын бири CRISPR/Cas9 технологияларын колдонуу менен геномду редакциялоо болуп саналат. Акыркы 7 жылдын ичинде биздин лаборатория бул жаатта жигердүү иш алып барууда, анын натыйжаларын клиникага которууга багытталган күчтүү далилдүү маалыматтар менен камсыз кылууда. Биз Европанын Дары-дармек Агенттиги тарабынан жетим дары белгисин алган ушул ыкмалардын бири менен клиникалык колдонуунун алдында турабыз. (EU/3/20/2253), биз геномду оңдоонун натыйжалуу, коопсуз жана клиникалык жактан ылайыктуу стратегияларын издөөнү улантабыз.

Бул долбоордо биз вирустук векторлорду колдонууну талап кылбаган генди редакциялоонун инновациялык ыкмасын сынап көрүүнү сунуштайбыз (бардык материал бир электропорация менен киргизилет). Максаты бул генетикалык аймакты CRISPR/Cas9 технологиясы менен кесип алгандан кийин мутацияланган аймактарды оңдоо үчүн бул “генетикалык тактарды” колдонуу. Биз төрт түрдүү "патчтарды" иштеп чыктык, бул dsDNA донордук шаблондору HDRге артыкчылык берүү үчүн провайдерибиздин (Интеграцияланган ДНК технологиялары, IDT) менчик технологиясы менен алардын аягында атайын өзгөртүлгөн. Бул шаблондор эки экзонду жана алардын айланасын (73 жана 80, ар бири экиден "патч") жана төрт түрдүү кесүү чекиттерин (эксон 73 үчүн эки жана экзон 80 үчүн эки) камтыйт. Бул калыптар (болжол менен 300-400 BP) кошуна экзондорду да камтыйт.

Биз “патчтардын” ичиндеги оңдоонун көлөмүн баалоону максат кылып жатабыз, бул бизге мутациялардын топторун чечүүгө же система жакшы иштесе, “патчтардын” ичиндеги экзондорду толук оңдоого мүмкүндүк берет. Биз бул роман, эч кандай вирустук, жекелештирилген генди редакциялоо стратегиясын клиникага оңой эле которуу мүмкүн деп эсептейбиз.

Биз гранттык көрсөткүчтөрдүн жарымына ийгиликтүү жеттик. Башында биздин стратегиябыз экзондордун жуптарын жабуу үчүн ДНК "патчтарын" колдонуп геномду кайра жазууну максат кылган (айрыкча экзон жуптарындагы мутацияларды максаттуу: 72-73, 73-74, 79-80 жана 80-81). Бирок биз колдонгон ДНК тактары биз күткөндөн бир аз башкача болуп чыкты. Бул тактар ​​геномду 80%дан ашык эффективдүүлүк менен кайра жаза алат, бул мурда билдирилгенден жогору, бирок алардын аракети тар терезе менен чектелет. Муну эске алып, биздин 2-фаза стратегиябыз эми ар бир экзон үчүн жеке ДНК патчтарына көңүл бурат. Дени сак ДНК тизмегин өзгөртпөө үчүн, CRISPR/Cas9 "молекулярдык кесүү" мутацияланган ырааттуулуктарды гана бутага алат. Бул ар бир мутация үчүн белгилүү бир кичинекей РНКларды талап кылат, ал эми ар бир экзон үчүн жалпы ДНК патч колдонсо болот. (2024-жылдын июлунан алынган отчет).